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Protein A Agarose主要用于免疫沉淀(IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，适合于免疫沉淀mouse IgG2a,IgG2b,IgA,rabbit IgG，以及human IgG1,IgG2和IgG4。也可以用于抗体的纯化。

• 请勿冷冻保存本制品。
  
• Protein A Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。
  
• 从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。

• 免疫沉淀(IP)：
  
  • 蛋白样品的准备：
    
    • 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500μL至2mL细胞裂解液裂解细胞。可以使用百奥莱博的WB及IP细胞裂解液(货号：YT038)或各种RIPA裂解液(YT609、YT610、YT611或YT612)等进行细胞的裂解。
      
    • 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
      
    • 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
      注：详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
  • 去除非特异性结合(可选做)：
    
    • 取200μL至1mL蛋白样品，蛋白量约为200μg至1mg，加入约1μg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20μL充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
      
    • 2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。
      注：所谓种属相同的IgG是指，例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。
  • 免疫沉淀：
    
    • 加入0.2～2μg用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。
      
    • 再加入20μL充分重悬的Protein A Agarose，4℃缓慢摇动1～3个小时。
      注：为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A Agarose的量调整为40μL。
      
    • 2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。
      
    • 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5～1mL。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3.c。
      
    • 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20～40μL 1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。
      
    • 100℃或沸水浴处理3～5分钟，取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳，暂时不用的样品可以-20℃保存。
• 免疫共沉淀(co-IP)：
  参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
  
• 抗体纯化：
  
  • 准备工作：
    
    • 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
      
    • 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
      
    • 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A Agarose装填纯化柱。
      
    • 用10～20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1mL/min。如无恒流泵，也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。
  • 抗体纯化：
    
    • 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
      
    • 待纯化的抗体过柱后，用10～20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
      
    • 洗涤完后，用10mL 50mM glycine，pH2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
  • 纯化柱的再生：
    
    • 用10～20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。
      
    • 用TBS来保存再生的纯化柱。